Биологическая фиксация азота

Основным резервуаром азота служит земная атмосфера.

Эукариотические организмы не способны усваивать азот непосредственно из атмосферы. Такой способностью обладает ограниченное количество видов прокариот, которых называют азотфиксаторами, а процесс связывания азота атмосферы (восстановление до этими организмами - биологической азотфиксацией.

Многие растения, животные и грибы способны вступать в симбиоз с азотфиксирующими прокариотами.

Наиболее интенсивно азотфиксация протекает при образовании эндосимбиозов, когда микроорганизм проникает внутрь тканей или даже в клетки хозяина. При этом микросимбионт обеспечивается питательными веществами и энергией, необходимой для разрыва тройной связи N2, а хозяин получает легко усваиваемый Биологическая азотфиксация представляет собой глобальный процесс, обеспечивающий существование жизни на Земле. Общая мировая биологическая фиксация азота составляет 17,2· т/год, что в четыре раза превышает связывание N 2 в форме NH 3 на предприятиях химической промышленности. При этом продуктивность симбиотической азотфиксации составляет 100-400 кг N/га.

Впервые прямые доказательства наличия азотфиксирующих микроорганизмов, живущих в симбиозе с бобовыми растениями, были получены благодаря работам немецкого исследователя Германа Гельригеля.

Сравнивая источники азота для злаков и бобовых (1886 год), он показал, что если злаки черпают азот из минеральных веществ почвы, то бобовые, кроме того, обладают способностью фиксировать азот воздуха. Такую способность бобовых Гельригель объяснял наличием на корневой системе клубеньков, развитие которых вызывают микроорганизмы. После работ Гельригеля стало ясно, что фиксация растениями азота связана с микроорганизмами, инфицирующими корневую систему растения.

Потребовалось около десятка лет для подтверждения выводов Гельригеля о значимости симбиотических микроорганизмов рода Rhizobium для бобовых растений как азотфиксаторов.

Голландский бактериолог М. Бейеринк (M. Beijerinck) выделил в 1888 году клетки Rhizobium в чистой культуре. В дальнейшем была показана их способность инфицировать корневую систему бобовых с определенной степенью избирательности по отношению к конкретным видам растений и вызывать образование на корнях клубеньков - специализированных образований, в которых протекает азотфиксация.

Сейчас известно около 13 тыс. видов бобовых, многие из которых обладают способностью к симбиотической фиксации азота. Для каждого вида бобовых растений имеются свои разновидности (штаммы) Rhizobium, которые и получили свои названия от названий хозяина (Rhizobium trifolii - клубеньковые бактерии клевера, Rhizobium lupini - клубеньковые бактерии люпина и т.д.). Выяснено также, что водный папоротник Azolla находится в симбиотических отношениях с азотфиксирующими цианобактериями.

Некоторые деревья и кустарники (например, ольха, облепиха, восковик) имеют в качестве симбионтов актиномицеты. Поиск новых азотфиксирующих пар растение - микроорганизм далеко не закончен. В 70-80-х годах нашего столетия в лаборатории доктора Джоан Доберейнер (J. Dobereiner) в Бразилии активизировались поиски азотфиксирующих микроорганизмов, обитающих на поверхности корневой системы диких и культурных злаков. Такие микроорганизмы, живущие в ассоциации с растением, называются ассоциативными азотфиксаторами. Число их видов велико, но благодаря работам доктора Дж.

Доберейнер и ее последователей в центре событий оказались микроорганизмы рода Azospirillum. Азоспириллы легко инфицируют корневую систему злаков и других растений.

Подобно Rhizobium, они делятся на виды, колонизирующие преимущественно те или иные сорта злаков, фиксируют азот воздуха, могут продуцировать гормоны роста растений и обладают еще другими свойствами, положительно влияющими на рост и развитие растений. Кроме того, известны азотфиксирующие микроорганизмы, свободноживущие в почве, на растениях, в воде.

Впервые выделить культуру свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов удалось в 1893 году С.Н. Виноградскому. Он выделил почвенный спороносный анаэробный микроорганизм, относящийся к роду Clostridium , названный автором в честь выдающегося французского микробиолога Л. Пастера Clostridium pasteurianum. В 1901 году М. Бейеринк выделил аэробно живущий почвенный микроорганизм Azotobacter, способный к азотфиксации, неприхотливый при выращивании. Этот микроорганизм интенсивно исследуют не только как удобную модельную культуру, но и применяют в технологии обогащения сельскохозяйственных посевов биологическим азотом. С тех пор коллекции свободноживущих азотфиксаторов постоянно увеличиваются, особенно с 1949 года, когда в арсенал методов регистрации фиксации азота вошли метод изотопных индикаторов ( ) и реакция восстановления ацетилена в этилен, катализируемая основным ферментом системы азотфиксации - нитрогеназой. Тогда выяснилось, что способностью к фиксации азота обладают большинство аноксигенных фототрофных бактерий, многие цианобактерии, некоторые бациллы, клебсиеллы и др.

Фиксация азота клубеньковыми бактериями.

Наибольший вклад в биологическую азотфиксацию вносят клубеньковыми бактериями (ризобии). Ризобии представляют собой грамотрицательные бактерии, образующие клубеньки с растениями семейства бобовых.

Клубеньковые бактерии теперь делят на пять родов: Azorhizobium, Rhizobium Mesorhizobium, Sinorhizobium (быстрорастущие) и Bradyrhizobium (медленнорастущие). В основе способности инфицировать корневую систему хозяина лежит сложнейший и не вполне ясный молекулярный механизм, имеющий решающее значение в симбиотической фиксации азота. На первом этапе происходит приближение микробной клетки к растению за счет ее способности передвигаться в ответ на узнавание химических продуктов, выделяемых из корней растения (хемотаксис). Происходит контактное взаимодействие микроорганизма с растением. В этом процессе важное место отводится так называемому лектин-углеводному узнаванию растения микроорганизмом.

Лектин корневых волосков растений (углеводузнающий белок) узнает углевод поверхности бактерий и прочно связывается с ним.

Происходит взаимное узнавание партнеров и подготовка к формированию симбиотической системы.

Растение в наноили пикомолярных концентрациях начинает продуцировать специфичные флавиноиды, которые активируют гены вирулентности (Nod-гены) ризобий. Nod-гены кодируют синтез Nod-факторов (липоолигосахаридов), вызывающих у растения-хозяина скручивание корневых волосков и образование клубеньковой меристемы. В месте резкого сгиба волоска пектолитические ферменты растения разрушают клеточную стенку, через которую бактерии и проникают внутрь.

Вокруг этих бактерий образуется полость – инфекционная нить, стенки ее образованы растительными клетками, а внутреннее пространство заполнено полисахаридами растения и микросимбионта. Далее происходит эндоцитоз ризобий из инфекционной нити внутрь клеток растения-хозяина. В цитоплазме растительной клетки бактерии окружаются специальными перибактероидными мембранами (ПБМ), синтезируемыми в основном растительной клеткой и частично ризобиями. Количество ризобиальных клеток внутри ПБМ зависит от вида растений и обычно составляет от 1 до 10 клеток.

Бактериальные клетки, окруженные общей ПБМ, называются симбиосомой и являются основной структурно-функциональной единицей симбиоза.

Вскоре ризобии в ПБМ преобразуются в особые симбиотические формы – бактероиды, имеющие в три-пять раз большие размеры, чем свободноживущие бактерии. Все это способствует формированию на поверхности корней клубеньков.

Азотфиксирующий клубенек состоит из следующих частей: а) инфицированная бактериями ткань, б) проводящая ткань, поставляющая углеводы и выносящая продукты азотфиксации, в) меристема, за счет которой идет рост клубенька. Морфология и число клубенька строго определяется растением-хозяином, что возможно связано с большой энергоемкостью их образования.

Клубеньковые бактерии более экономно используют энергию, необходимую для фиксации азота, затрагивая 3-4 г углеводов на 1 г азота, в то время как свободноживущие азотфиксирующие бактерии затрачивают 50 - 100 и более граммов на фиксацию 1 г азота. Это связано с тем, что у свободноживущих азотфиксаторов фиксация азота происходит в процессе их роста, и потому большое количество энергии потребляется на этот рост. Кроме того, в целях создания благоприятных условий для активности нитрогеназы - фермента, участвующего в фиксации азота, для снижения парциального давления кислорода усиливается дыхание, что связано с затратой энергии. Эти расходы энергии отсутствуют у клубеньковых бактерий, поскольку фиксация азота происходит в бактероидах, клетках, прекративших рост, а внутри клубеньков создаются благоприятные условия для активности нитрогеназы, в том числе сниженное содержание кислорода. Очень существенно то, что фиксируемый клубеньковыми бактериями азот на 90 - 95% передается бобовым растениям.

Бобовые, получая связанный азот от клубеньковых бактерий, не зависят или мало зависят от обеспечения минеральным азотом почвы и потому могут успешно произрастать совместно с другими растениями на почвах, бедных доступными формами азота.Количество азота, фиксируемого клубеньковыми бактериями бобовых, сильно варьирует от фитоценоза к фитоценозу, а в пределах конкретных фитоценозов может изменяться от года к году. Оно определяется участием бобовых в фитоценозах, условиями среды и эффективностью соответствующих рас бактерий. Для некоторых лугов в Новой Зеландии с травостоями, где преобладает клевер, отмечена фиксация азотом до 450 - 550 кг/га. Общий уровень азотфиксирующей активности свободно живущих организмов невысок. В зависимости от вида и условий существования они накапливают в год от 10 до 30 - 40 кг связанного азота на гектар . Биохимия азотфиксации.

Микроорганизмы, усваивающие молекулярный азот, называются диазотрофами.

Основным элементом симбиоза является нитрогеназа – многомерный фермент, состоящий из комплекса двух белков: MoFe-белка и Fe-белка.

Нитрогеназы из разных азотфиксаторов несколько различаются своими молекулярными массами и содержанием металлов.

Каждый из белков, в свою очередь, состоит из нескольких субъединиц.

Молекулярная масса MoFe-белка различных нитрогеназ находится в пределах 200-250 кДа.

Фермент содержит по два атома молибдена, 28-34 атома железа и 18-24 атома серы на одну молекулу.

Молекулярная масса Fe-белка колеблется от 50 до 70 кДа и также содержит атомы железа и серы.

Нитрогеназа синтезируется в бактероидах и является катализатором фиксации азота: N 2 + 8[H] + 2 2 + H 2 Этот процесс требует затраты энергии. По расчетам для клеток Rhizobium восстановление одной молекулы N 2 требует затраты 25-35 молекул АТФ, то есть на каждый грамм фиксированного азота расходуется три-шесть грамм органического углерода. Кроме АТР нужны также восстановленные пиридиннуклеотиды и ферредоксины в качестве восстановительной силы.

Нитрогеназа обладает низкой субстратной специфичностью, т.е. обладает способностью восстанавливать широкий спектр соединений, например, превращать ацетилен в этилен.

Данная реакция применяется для определения нитрогеназной активности ацетиленовым методом.

Ацетилен восстанавливается только до этилена, который легко поддаётся количественному определению с помощью газовой хроматографии. Для активной работы нитрогеназы необходимы микроаэрофильные условия.

Молекулярный кислород оказывает повреждающее действие на оба белка нитрогеназы, но более чувствителен к O 2 Fe-белок.

Чувствительность белков нитрогеназы к O 2 определяется прежде всего чувствительностью их металлоцентров, которые участвуют как в связывании субстрата, так и в переносе электронов.

Поскольку при этом может происходить и ступенчатое восстановление O 2 по одноэлектронному механизму, в качестве продуктов такого восстановления возникают супероксидные ионы, перекись водорода и синглетный кислород, вносящие свой вклад в окислительное повреждение нитрогеназы.

Нитрогеназные белки являются не единственным компонентом азотфиксирующей системы, чувствительным к O 2 . Ферредоксины и флаводоксины, донирующие электроны на нитрогеназу, могут автоокисляться и подвергаться необратимым окислительным повреждениям.

Микроаэрофильные условия в клубеньке обеспечиваются диффузным барьером (слой плотно прилегающих друг к другу клеток во внутреннем кортексе) и синтезом леггемоглобина (гемоглобинподобный белок, синтезируемый растительными клетками) . Леггемоглобин связывает O 2 , транспортирует его к симбиосомам, обеспечивая дыхательную активность клубеньков. Он составляет 30 % белка в клубеньках и придает им ярко-розовый цвет.

Нитрогеназный комплекс, образующий аммиак из воздуха, действует по очень экономно. Если в среде обитания достаточно ионов аммония или нитратов, он прекращает работу.

Потребление растениями аммиака, образовавшегося при азотфиксации или восстановлении нитратов почвы, осуществляется ферментами, связанными с биосинтезом так называемых первичных аминокислот, прежде всего глутаминовой, аспарагиновой кислот и их амидов. Одним из активно изучаемых ферментов является, например, глютаминсинтетаза. Этот фермент катализирует реакцию глутаминовая кислота + NH 3 + АТР глутамин + A DP + P i Этот фермент встречается во всех организмах и принимает участие в присоединении аммиака к глутаминовой кислоте с образованием ее амида и последующим использованием его в различных реакциях синтеза азотсодержащих органических соединений.

Близким по механизму действия является и аспарагинсинтетаза: аспарагиновая кислота + + NH 3 + АТР аспарагин + A DP + P i Синтез аминокислот и амидов происходит с участием и других ферментов: глутаматдегидрогеназы, аспартазы и т.д. В конечном итоге азот в виде аминогрупп вовлекается в серию биосинтетических реакций организма, поддерживая его жизненные функции.

Применение азотфиксаторов на практике.

Открытие азотфиксаторов привело к созданию так называемых микробных удобрений. Уже в 1895 году Наббе и Хилтнером запатентован препарат микробной культуры Nitragin. Он выпускался в 17 вариантах для различных растений.

Препарат представлял собой культуры азотфиксирующих микроорганизмов, смешанных с почвой, торфом, песком, навозом и другими субстратами.

Внесение нитрагина в почву или обработка семян назывались инокуляцией и позволяли фермеру повысить качество и количество продукции. В первой половине XX века наблюдался неуклонный рост научно-исследовательских работ по созданию перспективных микробных препаратов для бобовых и небобовых культур. После второй мировой войны начался период химизации сельскохозяйственного производства и работы по исследованию микробиологических препаратов стали свертываться.

Возможности большой химии, дешевизна азотных удобрений, простота их использования как бы отодвигали на второй план микробные препараты.

Однако выяснилось, что интенсивное использование синтетических азотных удобрений кроме положительного эффекта (роста урожайности) несут в себе большую опасность.

Происходит загрязнение азотсодержащими веществами почвы, подпочвенных вод, рек и озер.

Минеральные удобрения вымываются из почвы, выщелачиваются и становятся вредными для человека соединениями - нитритами, нитрозаминами и т.д. поэтому в последнее время отдаётся предпочтение микробным препаратам.

Сейчас спектр применяемых микропрепаратов под бобовые, злаковые и другие культуры довольно широк.

Штаммы ризобий, используемые для инокуляции сельскохозяйственных бобовых культур, обычно выделяются из клубеньков этих же видов, однако в качестве источника таких штаммов могут быть использованы и некоторые дикорастущие виды бобовых. В конце XX века во многих странах нитрагенизации подвергается 70-80 % бобовых культур. В районах традиционного возделывания бобовых культур прибавка урожая от применения нитрагина оставляет 2-4 ц/га зерна сои, 1-2 ц/га зерна гороха и люпина, 80-100 ц/га зеленой массы бобовых культур, 6-12 ц/га сена клевера и люцерны. На почвах, где бобовые культуры ранее не возделывались и в которых нет специфичных для них клубеньковых бактерий, дополнительный сбор сельскохозяйственной продукции за счет применения препаратов клубеньковых бактерий достигает 50-100 % и более.

Литература.

оценка стоимости аренды помещения в Москве
оценка аренды в Калуге
оценка машин для наследства в Туле