Векторные системы для молекулярного клонирования в Bacillus subtilis

Скачать работу - Векторные системы для молекулярного клонирования в Bacillus subtilis

Однако существует целый ряд бактерий обладающих свойствами, которые не присущи E . coli . Как правило, это грамположительные микроорганизмы, и чтобы изучать и использовать на практике их свойства разрабатываются векторные системы, учитывающие специфику данных микроорганизмов. Одним из таких микроорганизмов являются грамположительные бактерии Bacillus subtilis . По изученности генетического аппарата клетки Bacillus subtilis находятся на втором месте после E . coli . Для них характерен нечасто встречающийся среди бактерий процесс споруляции, и в этом плане они представляют значительный теоретический и практический интерес. B . subtilis имеют важное практическое значение: они широко используются в различных процессах ферментации при промышленном получении антибиотиков и ферментов и в этом отношении обладают рядом ценных свойств, таких как способность секретировать синтезируемый белковый продукт в культуральную жидкость, способность расти на дешёвых субстратах и обладать продуктивностью на один-два порядка выше, чем у грамотрицательных бактерий-продуцентов.

Поскольку B . subtilis обладают целым рядом описанных выше свойств, для этого организма было разработано множество разнообразных векторных систем. В данной работе расмотрены основные типы векторных систем, с помощью которых можно производить различные генетические манипуляции в клетках B . subtilis . ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Первоначально большая часть векторов для B . subtilis создавалась на основе геномов умеренных фагов (таких, как rho 11 и phi 105) , т.к. они обладали большей стабильностью, чем векторы на основе плазмид, реплицирующихся по типу катящегося кольца ( rolling - circle - replication , RCR -плазмиды) (Негрук, 1991). В настоящее время большинство векторов конструируется на основе репликонов тета-плазмид, обладающих высокой структурной и сегрегационной стабильностью. Кроме того, в последнее время разработан ряд так называемых геномных векторов предоставляющих дополнительные возможности по сравнению с плазмидными векторами. 1.1. Клонирующие векторы В штаммах B . subtilis содержится незначительное число естественных плазмид, причём большинство из них являются криптическими.

Однако из других видов рода Bacillus , а также других родов грамположительных бактерий, было выделено множество плазмид, способных к автономной репликации в клетках B . subtilis . Первоначально плазмидные векторы для B . subtilis конструировались на основе мелких (размером меньше 10 kb ) плазмид различных грамположительных бактерий, в первую очередь на основе плазмид, выделенных из Staphylococcus aureus ( pC 194, pE 194, pUB 110 и др.). Однако векторные молекулы, полученные на основе таких плазмид, проявляли высокую структурную нестабильность, и с их помощью можно было клонировать только короткие сегменты ДНК, а длинные сегменты часто подвергались перестройкам ( Michel et al., 1980; Ehrlich et al ., 1986). Нестабильность мелких плазмид в клетках B . subtilis обусловлена механизмом их репликации.

Указанные плазмиды реплицируются по типу катящегося кольца ( RCR плазмиды), а вследствие разобщённости синтеза лидирующей и отстающей цепей, в процессе репликации образуется одноцепочечная ДНК, которая сильно стимулирует рекомбинацию между гомологичными последовательностями ( Ehrlih et al , 1986). Одноцепочечный надрез, образуемый во время инициации репликации, также может быть причиной рекомбинации ( Michel , Ehrlich , 1986; Baliester et al ., 1989; Gros et al ., 1989). Кроме того, вставки ДНК могут вызвать образование высокомолекулярных конкатемеров, увеличивая число копий плазмиды ( Gruss , Ehrlich , 1989; Dabert et al ., 1992), что может повысить частоту рекомбинации, а также поспособствовать отбору плазмид, утративших вставки.

Существует также другой тип плазмид, реплицирующихся в соответствии с механизмом тета-типа. При репликации по этому механизму не образуется интермедиатов в виде одноцепочечной ДНК, и по этой причине векторы, созданные на основе тета-репликонов гораздо стабильнее и, следовательно, эффективнее векторов на основе RCR плазмид.

Первые данные об этом были получены в экспериментах по получению и изучению свойств клонирующих векторов pHV 1431, pHV 1432, pHV 1435 и pHV 1436 ( Janniere et al ., 1990). Челночный вектор pHV 1436 (рис. 1) был создан на основе репликона плазмиды pTB 19. На основе репликона pAM b 1 были сконструированы три клонирующих вектора: pHV 1431, и полученные из него pHV 1435 (путём инверсии rep -области pAM b 1) и вектор pHV 1432 (путём делеции небольшого фрагмента в последовательности rep -области pAM b 1). Рис. 1. Структура клонирующих векторов. ori pTB 52 и ori pAM b 1, репликационные регионы природных плазмид pTB 19 и pAM b 1 соответственно; pBR 322, последовательность pBR 322, включающая её репликационный регион; Данные векторы оказались структурно намного более стабильными, чем векторы на основе сигма-репликонов ( Janniere et al ., 1990): (1) при их использовании наблюдается гораздо более низкая частота рекомбинации между повторяющимися последовательностями (снижена в 1000 раз) (2) с их помощью можно клонировать значительно более длинные сегменты ДНК; средний размер вставки 10 и 1 kb , с диапазоном 3 -17 kb и 0.1 - 1.7 kb для векторов на основе тета и сигма репликонов соответственно (3) в отличие от RCR плазмид они способны к стабильному поддержанию больших сегментов ДНК Данные свойства характерны и для других векторов, являющихся производными тета-плазмид. Кроме того, было показано, что в отличие от сигма-плазмид, тета-репликоны, со вставками или без них, не образуют или образуют незначительное число высокомолекулярных конкатемеров ( Gruss , Ehrlich , 1988; Dabert et al ., 1992 a ; Dabert et al ., 1992 b ). Это также является одной из причин их структурной стабильности.

Помимо клонирующих векторов для Bacillus subtilis был создан ряд векторов специального назначения: векторы экспрессии, клонирования промоторов и терминаторов, векторы с регулируемой копийностью и т.д. При этом используются векторы на основе как сигматак и тета-репликонов. 1.2. Векторы экспрессии В простейшем случае для экспрессии достаточно клонировать нужный ген вместе с его промотором и сайтом связывания с рибосомой ( ribosome binding site , RBS ) в природную плазмиду, способную реплицироваться в хозяине, в котором нужно проэкспрессировать данный ген. Так, например, в B . subtilis был проэкспрессировать ген термостабильной арабиназы термофильной бактерии Bacillus thermodenitrificans . Для этого фрагмент, содержащий данный ген (с предполагаемым промотором и RBS ) был клонирован в природную плазмиду pUB 110 ( Takao et al ., 2002). Иногда удобно экспрессировать ген с не своего промотора, что позволяет вести экспрессию на более высоком уровне, или контролировать её. Так, ген термоактивной пуллуланазы гипертермофильной анаэробной архебактерии Desulfurococcus mucosus (apuA) был успешно экспрессирован в B . subtilis ( Duffner et al ., 2000). Экспрессия гена шла под контролем промотора PamyM (рис. 2). Рис. 2. Структура вектора pJA 803 для клонирования пуллуланазы. RepB - область репликации pUB 110; Cm - ген устойчивости к хлорамфениколу; apuA - ген пуллуланазы; PamyM - промотор гена мальтогенной a -амилазы из B. stearothermophilus. В обоих вышеописанных случаях наблюдался относительно невысокий уровень экспрессии, однако, белки секретировались в среду в количестве, позволяющем их выделение в чистом виде и дальнейшее изучение свойств. В случае, когда необходимо регулировать уровень экспрессии или экспрессировать белок в очень больших количествах, используют более сложные системы экспрессии. B . subtilis является очень удобным организмом для проведения в нём экспрессии различных продуктов, т.к. эта бактерия обладает целым рядом полезных свойств: непатогенность, наличие механизмов секреции, хорошо изученные генетика и условия необходимые для экспрессии генов, простота манипуляций с использованием стандартных протоколов. Для повышения уровня продукции гетерологичных белков в клетках B . subtilis используют штаммы, дефектные по протеазам. Кроме того, можно применить более эффективные регуляторные элементы транскрипции и трансляции. Так, например, была создана кассета Veg (Lam et al ., 1998) содержащая сильные регуляторные элементы, подходящие для эффективной экспрессии и секреции гетерологичного белка. В состав кассеты вошли: промотор B . subtilis veg I ; lac оператор E . coli ; сайт связывания с рибосомой ( RBS ) B . subtilis ; лидерная последовательность стафилококкового белка А ( SPA ); терминатор транскрипции глюконатового оперона B . subtilis ( gnt ); полилинкер ( multiple cloning site , MCS ), содержащий сайты рестрикции Xba I , Sma I ; стоп кодоны для всех рамок считывания; фланкирующие EcoR I и Kpn I сайты (рис.3). Рис. 3. Схематичное изображение регуляторных элементов в кассете Veg . Длина кассеты 356 п.н. RBS - сайт связывания рибосомы; SPA - стафилококковый белок А; MCS - полилинкер.

Подробности в тексте.

Кассета Veg была вставлена в полилинкер челночного вектора pM 2 (рис. 4) с образованием pM 2 Veg – вектора для экспрессии и секреции белка в B . subtilis . Для проверки эффективности функционирования вектора pM 2 Veg , в качестве гена-репортёра применили ген эндоглюконазы (ген cenA из Cellulomonas fimi ). Была осуществлена вставка данного гена в сайт Xba I вектора pM 2 Veg . С помощью данной системы была достигнута продукция эндоглюконазы на уровне более чем в четыре раза превышающем самый высокий из уровней продукции достигнутых с помощью других систем экспрессии.

Экспрессия и секреция белка оставалась на стабильном уровне, и не оказывала ни каких неблагоприятных эффектов на стабильность вектора и жизнеспособность клеток. Рис. 4. Схематичное изображение векторов pM 2 и pM 2 Veg . ori pMB 1 и ori pUB 110 - репликационные регионы плазмид pMB 1 и pUB 110, соответственно; - гены устойчивости к ампициллину, блеомицину и неомицину, соответственно. С помощью pM 2 Veg в B . subtilis также экспрессирован ген hEGF – ген фактора роста эпидермиса человека.

Регистрируемый уровень hEGF был вполне сопоставим с уровнем экспрессии данного гена при использовании других систем. Эти данные указывают на то, что вектор pM 2 Veg может успешно использоваться для экспрессии в B . subtilis разнообразных гетерологичных белков. Ещё одна эффективная система экспрессии разработана на основе ксилозного оперона ( Bhavsar et al ., 2001). Созданная система экспрессии состоит из следующих элементов (рис.5 b ): 1) P xylA , под контролем которого идёт экспрессия клонированного гена; 2) - концевой участок гена xylA (ген изомеразы ксилозы), содержащий оптимизированный CRE ( catabolite - responsive element ) - цис-действующий элемент, репрессирующий транскрипцию xyl оперона; 3) xylO , с которым в отсутствие индуктора (ксилозы) связывается репрессор XylR ; 4) xylR , кодирующий репрессор XylR , со своим промотором P xylR . Система была вставлена в вектор pDG 364 ( Cutting , Horn , 1990), способный интегрировать с хромосомой B . subtilis в сайте amyE путём двойного кроссинговера. Таким образом, полученный вектор, обозначенный как pSWEET , позволяет осуществлять встраивание ксилозной системы экспрессии в хромосому B . subtilis . Для определения эффективности функционирования данной системы экспрессии к её проксимальному концу был пришит репортёрный ген bgaB – ген термостабильной b -галактозидазы из B. s tearothermophilus (полученная плазмида обозначена как pSWEET - bgaB ) (рис.5 b ). bgaB можно вырезать вместе с RBS с помощью PacI и одной из рестриктаз для полилинкера, и заменить его любым интересующим геном.

	PacI

b

a

MCS

Рис. 5. a ) Структура плазмиды pSWEET - bga B . AmyE - сайты через которые идёт рекомбинация и интеграция с хромосомой; Cm и Amp - гены резистентности к хлорамфениколу и ампициллину, соответственно; ori - область репликации в E . coli ; Pac I , сайт рестрикции; b ) ксилозная система экспрессии крупным планом.

Показаны: ген ксилозного репрессора xylR ; промоторы генов xylR ( PxylR ) и xylA ( PxylA ) и оператор xylO ; урезанный xylA (первые 58 п.н. + TAA ), включающий в себя оптимизированный CRE ; сайт связывания рибосомы гена tagD ( RBS ); ген bgaB , кодирующий термостабильную b -галактозидазу.

Данная система экспрессии (далее система xyl ) была сравнена с широко применяемой системой экспрессии spac , основанной на применении лактозных репрессора и оператора E . coli для контроля экспрессии в B . subtilis . Для этого был использован вектор pSPAC - bgaB , созданный путём вставки bgaB в плазмиду pDR 67( Weickert , Chambliss , 1990), содержащую spac систему для интеграции в сайт amyE . Для обеих систем экспрессии сайты связывания с рибосомой и окружающие генетические элементы были одинаковые. Опыты показали, что 1) для системы xyl характерна значительно более высокая разница между уровнем синтеза продукта при индукции и при репрессии (экспрессия при индукции в 279 раз выше, чем при репрессии; для spac системы – в 16 раз); 2) уровень экспрессии при индукции в 16 раз выше, чем у spac системы; 3) в отсутствие индуктора уровень экспрессии ниже, чем у spac системы; 4) система xyl проявляет чувствительность к большему диапазону концентраций индуктора. Была протестирована способность системы xyl обеспечивать ксилоз-зависимую комплементацию. Была проведена попытка комплементировать термочувствительные мутанты ( tag -12) по tagD гену, кодирующему фермент, участвующий в синтезе тейхоевых кислот (глицерол-3-фосфат цитидилтрансфераза). Ген tagD дикого типа был клонирован в pSWEET (с образованием pSWEET - tagD ) для экспрессии под контролем системы экспрессии xyl . Мутанты с интегрированной в amyE с помощью pSWEET - tagD системой экспрессии и геном tagD под её контролем были способны к росту при непермессивной температуре в присутствии индуктора (ксилозы). Т.е. при росте при непермиссивной температуре происходила ксилоз-зависимая комплементация данного температур зависимого мутанта tag -12 . Таким образом было показано, что pSWEET является эффективной системой для точно регулируемой экспрессии клонированных генов в B . subtilis и, в частности новой эффективной системой экспрессии для условной комплементации в B . subtilis . 1.3. Векторы для клонирования промоторов Наиболее удобные и универсальные системы созданные для изучения активности промоторов in vivo представляют собой плазмиду, несущую ген лишённый промотора, кодирующий продукты, легко поддающиеся количественному анализу (ген-репортёр). Фрагмент ДНК, чью промоторную активность необходимо проанализировать, можно вставить перед геном репортёром. По выходу продукта гена затем можно определить активность данного промотора. Для грамположительных бактерий сконструировано ряд плазмидных векторов для измерения активности промоторов, где в качестве гена-репортёра выступает ген b -галактозидазы или хлорамфеникол ацетилтрансферазы (без промоторов). Главным недостатком этих векторов является их высокая копийность, что мешает их использованию для точного измерения активности промотора in vivo . кроме того, они часто имеют узкий круг хозяев.

Создан мобилизуемый малокопийный челночный вектор pTCV - lac ( Poyart C ., Tieu Cuot ., 1997) с широким кругом хозяев.

Вектор сконструирован на основе двух репликонов - pACYC 184 и pAM b 1 (рис.6), что позволяет ему реплицироваться в клетках E . coli и в широком круге грамположительных бактерий ( Bacillus , Enterococcus , Listeria , Streptococcus ). Точка начала переноса плазмиды RK 2 обеспечивает способность к переносу при конъюгации из клетки-донора E . coli в различные грамположительные бактерии. Роль гена-репортёра выполняет ген b галактозидазы (без промотора). Вектор присутствует в клетках в количестве 3-5 копий на хромосому; данная малокопийность позволяет точно измерять активность промоторов. Рис. 6. Структура вектора pTCV - lac . oriR pACYC 184 и oriR pAM b 1 - rep -области плазмид pACYC 184 и pAM b 1, соответственно; ermB - ген устойчивости к эритромицину; aphA -3 - ген устойчивости к канамицину; lacZ безпромоторный ген, кодирующий b -галактозидазу, с сайтом связывания рибосомы для грамположительных бактерий ( spoVG ); ori T RK 2, точка начала переноса плазмиды RK 2. C конструированный вектор был использован для сравнения активности четырёх промоторов( Ptac , Ptrc , Pspac , PaphA -3) в двух грамположительных палочках ( B . subtilis и Listeria monocytogenes ) и двух грамположительных кокках ( Enterococcus faecalis и Streptococcus agalactiae ). Для этого осуществлялась вставка фрагментов EcoR I - BamH I в линеаризованный путём рестрикции рестриктазами EcoR I и BamH I вектор. Во всех данных хозяевах производные вектора оказались стабильными.

Показано, что активность исследуемых промоторов, измеренная путём определения активности b -галактозидазы, сильно варьирует в зависимости от вида хозяина, в котором исследуется активность данного промотора. Эти данные показывают, что вектор pTCV - lac можно успешно использовать для анализа регуляции генов в широком круге грамположительных бактерий. 1.4. Векторы с регулируемой копийностью Сконструированы векторы для грамположительных бактерий, позволяющие уменьшать количество их копий на клетку (Renault et al ., 1996). Эти векторы созданы на основе pILnew - малокопийного вектора, построенного на основе репликона pAM b 1, несущего ген резистентности к эритромицину и способного реплицироваться в большинстве грамположительных бактерией. Этот вектор, как и все полученные из него производные, несут репликационный регион pAM b 1, содержащий необходимый для репликации ген repE (кодирует белок репликации RepE ) и его регулятор copF . Ген copF был инактивирован путём введения вставки в уникальный сайт Kpn I . Так как продукт copF оказывает репрессирующее действие на экспрессию repE , его инактивация ведёт к увеличению копий плазмид на клетку примерно в 20 раз.

Первоначальное состояние малокопийности может быть восстановлено с помощью удаления вставки путём его вырезания из Kpn I и последующей сшивки.

Вектор pILnew был использован для создания (1) клонирующих векторов, (2) векторов для изучения регуляции генов путём клонирования их промоторов и сайтов связывания с рибосомой, (3) векторов для экспрессии генов, (4) кассет, содержащих репликон с различными полилинкерами, которые способствуют созданию новых векторов. Рис. 7. Структура векторов.

Обозначения сайтов рестрикции: E ( Eco RI ); B ( Bss HII ); N ( Nde I ); K ( Kpn I ); B ( Bgl II ). Em и Cm – гены устойчивости к эритромицину и хлорамфениколу, соответственно. repE – ген, кодирующий необходимый для репликации белок RepE ; orfD – ген-регулятор транскрипции repE ; с opF - ген репрессора ( CopF ) транскрипции кластера repE orfD ; PorfD - repE - промотор кластера repE - orfD ; Pres - промотор гена резольвазы res b . MCSpBS -часть MCS плазмиды pBluescript ; oriC - репликационный регион pBluescript . Для того чтобы с помощью pILnew можно было осуществлять клонирование, в него был введён полилинкер в различной ориентации с образованием клонирующих векторов pJIM 2278 и pJIM 2279. Сконструирован ряд векторов, позволяющих измерить активность промоторов с помощью бактериального люциферазного гена из Vibrio harvei в качестве гена-репортёра.

Данный ген-репортёр обладает рядом полезных свойств: высокая чувствительность, возможность быстрого измерения активности, отсутствие фоновой активности в грамположительных бактериях. Были использованы два варианта генов люциферазы. В первом случае применялся кластер генов luxA и luxB ( luxA / B ), во втором - продукт слияния генов ( luxAB ). Преимущество системы luxA / B над luxAB заключается в её высокой термоустойчивости ( luxAB инактивируется при температуре выше 37 ° C ) и в отсутствии токсичности в E. coli , что позволяет создавать конструкции в этом удобном промежуточном хозяине перед их переносом в окончательного хозяина.

Однако эти гены могут слабо транслироваться в некоторых грамположительных бактериях, и использование слитых luxAB генов значительно улучшает чувствительность системы в некоторых хозяевах.

Векторы pJIM 2366 и pJIM 2367 содержат luxA / B гены дистальнее полилинкера и двунаправленный терминатор his оперона Lactococcus lactis для предотвращения транскрипции с проксимально расположенных промоторов. В данных векторах было успешно протестировано ряд промоторов из L . lactis при низком и высоком числе копий вектора (промоторы оперонов mle , his и ald из L . lactis ). Активность многих генов регулируется на уровне трансляции.

Поэтому была создана версия luxAB гена, позволяющая изучать эффективность сайтов связывания с рибосомой ( RBS ) для инициации трансляции. Для этого на уровне инициаторного кодона гена luxAB был введён сайт Nde I , что позволило осуществлять вставку RBS сразу перед стартовым кодоном этого гена.

Транскрипция гена luxAB при этом может инициироваться с промоторов, расположенных проксимальнее.

Вектор pJIM 1715, содержащий слитый ген luxAB без RBS не проявлял люциферазную активность. В данный вектор была осуществлена вставка различных фрагментов гена aldB L . lactis , RBS (конструкция pJIM 1723), RBS и антиRBS ( pJIM 1728), а также RBS и промотор данного гена ( pJIM 1726). Данные, полученные с помощью указанных конструкций, показали, что pJIM 1715 можно успешно использовать для изучения трансляционной эффективности RBS . Часто необходимо, чтобы синтез продукта гена шёл на определённом уровне. Для достижения этого можно использовать регулируемые промоторы различной силы.

Изменение дозы гена предоставляет дополнительный уровень контроля экспрессии гена. Чтобы показать, что для этой цели можно использовать производные pILnew , в pJIM 2279 была осуществлена вставка lux генов и была измерена люциферазная активность при низком и при высоком числе копий вектора. При этом сначала измерялась активность экспрессии с промоторов расположенных в pJIM 2279 проксимальнее MCS (промотор кластера orfD - repE и промотор гена резольвазы), а затем с промоторов клонированных в pJIM 2366 и pJIM 2367(см. выше). Данные показали, что наблюдается чёткая корреляция между дозой гена (количество копий вектора на клетку) и уровнем люциферазной активности. Был сконструирован клонирующий вектор pJIM 2375, содержащий промотор mleS для конститутивной экспрессии на среднем уровне в L . lactis , RBS и сайт для клонирования Nde I . На основе pILnew были созданы производные векторов pJIM 2278 и pJIM 2279, в которых репликон pILnew может быть отделён от маркера резистентности путём разреза одной рестриктазой в уникальном сайте рестрикции. На основе этого репликона можно затем создавать новые векторы несущие различные маркеры или гены-репортёры. pJIM 2244 и pJIM 2245 являются производными pJIM 2279, содержащими гены устойчивости к эритромицину и хлорамфениколу соответственно. В этих конструкциях из всего полилинкера pJIM 2279 оставлен единственный сайт Eco RI (в pJIM 2245 также часть MCS плазмиды pBluescript ). pJIM 2241 и pJIM 2246 являются EmR и Cm R производными pJIM 2278 соответственно и содержат большую часть полилинкера pJIM 2278 на конце BssH II фрагмента содержащего репликон.

Первые две плазмиды созданы для восстановления репликона pILnew без дополнительных сайтов рестрикции.

Другие две плазмиды позволяют менять маркер, в то время как гены, клонированные в полилинкере, остаются связанными с репликоном. 1.5. Векторы для направленной инактивации генов Функции не охарактеризованных генов можно изучить путём их инактивации и последующего наблюдения эффекта инактивации при различных условиях роста клетки. Для проведения инактивации генов в B . subtilis создан набор векторов для осуществления инсерционного мутагенеза в хромосоме бактерии ( Vagner et al .,1998). Данные векторы, обозначенные как pMUTIN , построены на основе репликона ColE 1 (рис.8), поэтому они не способны реплицироваться в конечном хозяине ( B . subtilis ), что необходимо для проведения инсерционного мутагенеза. Они содержат ген-репортёр lacZ для измерения активности промотора исследуемого гена. Также в векторах присутствует индуцибельный промотор Pspac , необходимый для контроля экспрессии генов, находящихся в одном опероне с исследуемым геном и расположенным дистальнее от него.

Данный промотор необходим из-за возможного полярного эффекта вставки.

Промотор Pspac был модифицирован для лучшего контроля его активности. Он репрессируется репрессором LacI (кодируется геном lacI , присутствующим в векторе) и, следовательно, может быть индуцирован IPTG , инактивирующим LacI .

pMUTIN	терминатор	оператор	MCS
1	t 0	O1	есть
2	t 1 t 2 t 0	O1	нет
3	t 0	oid	есть
4	t 1 t 2 t 0	oid	нет

Рис. 8. Структура векторов pMUTIN . Общие черты векторов pMUTIN показаны на рисунке.

Различия между векторами pMUTIN указаны в таблице справа от рисунка. Белые боксы являются генами экспрессируемыми в B . subtilis , чёрные боксы - гены экспрессируемые в E . coli . ori - область репликации ColE 1. ApR и EmR , гены резистентности к ампициллину и эритромицину соответственно. lacZ , модифицированный ген b -галактозидазы - ген lacZ c RBS гена spoVG B . subtilis и стоп кодонами в трёх возможных рамках считывания; Pspac , индуцируемый промотор, содержащий последовательности распознавания РНК-полимеразой фага SPO 1 и один из lac операторов - O 1 или оператор oid ; lacI , ген репрессора LacI модифицированный для конститутивной экспрессии в B . subtilis ; Ter - терминаторы: l t0 присутствует во всех векторах ; t 1 t 2 (сильные терминаторы из rrnB ) в pMUTIN 2 и pMUTIN 4. Op - оператор LacI между промоторными последовательностями Pspac : O 1 оператор присутствует в pMUTIN 1 и pMUTIN 2; оператор oid присутствует в pMUTIN 3 и pMUTIN 4. Различия между векторами pMUTIN указаны в таблице справа от рисунка.

Исследуемый ген можно инактивировать в результате одиночного кроссинговера между вставкой, осуществленной в вектор pMUTIN и геном, локализованным на бактериальной хромосоме (рис.9). Для этого внутренний фрагмент изучаемого гена амплифицируется с помощью ПЦР, клонируется в полилинкер pMUTIN , и получившаяся конструкцию используется для трансформации клеток B . subtilis . В результате интеграции ген прерывается и происходит транскрипционное слияние между его промотором и lacZ геном-репортёром. Если данный ген является частью оперона, то остальные дистально расположенные гены оказываются под контролем промотора Pspac . При этом терминатор l Pspac предотвращает транскрибирование этих генов с других проксимально расположенных промоторов.

Данные манипуляции приводят к образованию сразу двух типов мутантов: нулевых мутантов (по orf 2) в результате разрыва гена и условных мутантов (по orf 3) зависимых от IPTG . Рис. 9. Интеграция pMUTIN в исследуемый ген. Гены оперона orf 1- orf 3 показаны в виде белых боксов.

Заштрихованный ген соответствует внутреннему сегменту исследуемого гена.

Вектор интегрируется в orf 2 путём одиночного кроссинговера.

Стрелки обозначают направление транскрипции, изломанные стрелки обозначают промотор оперона и Pspac . Созданы векторы для проведения инсерционного мутагенеза в штаммах вида Bacillus cereus , основанного на встраивании мобильного элемента IS 231 A в случайные сайты хромосомы бактерии ( Leonard et al .,1998). Созданные векторы pGIC 055 и pGIC 057 представляют собой версии одной плазмиды и построены на основе термочувствительного репликона pHT 1030. В своём составе они имеют: 1) mini - IS 231 A , включающий в себя селективный маркер (устойчивость к канамицину [pGIC057] или спектиномицину [pGIC055]) и полилинкеры между инвертированными повторами; 2) ген транспозазы IS 231 A ( TnA ), находящийся под контролем сильного промотора Pdeg; 3) дополнительный маркерген устойчивости к эритромицину . Транспозицию mini - IS 231 A из плазмид pGIC 055 или pGIC 057 в хромосому осуществляли при температуре 28 ° С. Плазмиды затем элиминировали путём повышения температуры культивирования до 46 ° С. Выяснилось, что в хромосоме Bacillus cereus имеется один сайт сильно предпочтительный для транспозиции mini - IS 231 A (левый инвертированный повтор транспозона Tn 4430). Если в данный сайт уже осуществлена вставка, последующие вставки осуществляются в случайные сайты. Путём повторной вставки были получены ряд ауксотрофных мутантов. С использованием рестрикционного анализа данные мутации (также как и предпочтительный для транспозиции сайт) были локализованы на карте хромосомы B . cereus . Рис. 10. Структура векторов pGIC 055 и pGIC 057. ori - репликативный регион pHT 1030; TnpA - ген транспозазы; MCS 2 - полилинкеры; Pdeg - сильный промотор; инвертированные повторы обозначены черными треугольниками; детерминанты устойчивости: Em R - к эритромицину, mini - IS - к спектиномицину ( pGIC 055) или канамицину ( pGIC 057). Из мутанта ауксотрофного по аденину была вырезана вставка mini - IS 231 A вместе с прилегающими участками путём рестрикции Eco RI (в mini - IS сайт для данной рестриктазы отсутствует). Путём секвенирования и сравнения с последовательностями из баз данных было выявлено, что сайт, в который была осуществлена вставка, имеет высокую степень гомологии с генами pur оперона B . subtilis , что может указывать на то, что вставка mini - IS 231 A произошла в один из генов синтеза пуринов.

Данные результаты показывают, что рестрикционный анализ вместе с секвенированием позволяют создавать объединённые физические и генетические карты бактериальной хромосомы B . cereus . Данную систему можно использовать для проведения инсерционного мутагенеза также в других грамположительных бактериях, способных расти при температуре выше 45 ° . В геноме B . cereus (как и в большинстве других прои эукариотических геномов) отсутствует сайт рестрикции I - Sce I . Данный сайт присутствует в полилинкере mini - IS . Поэтому последовательное введение двух mini - IS , несущих два разных маркера резистентности, в хромосому приводит к получению фрагмента ограниченного двумя сайтами I - Sce I . Таким образом, путём рестрикции I - Sce I можно получать фрагменты, подходящие для секвенирования.

Данный метод позволяет избежать ряда трудностей встречающихся при использовании традиционных методик клонирования. 1.6. Векторы для получения гибридных белков B . subtilis долгое время изучается как образец простой клеточной дифференцировки т.к. при голодании у неё запускается программа дифференциальной экспрессии генов называемая споруляцией.

Изучение споруляции в свою очередь привели исследованию процессов происходящих в течение клеточного цикла, в частности клеточного деления, сегрегации хромосом и синтеза макромолекул. В проведении этих исследований важную роль играет использование зелёного флуоресцирующего белка GFP ( green fluorescent protein ), применяемого в качестве цитологического маркера.

Слияние кодирующего его гена gfp с другими генами позволяет получать гибридные белки, локализацию которых можно проследить в живых клетках. Для этой цели было разработано ряд векторов ( Lewis P . J , Marston , 1999; Feucht A ., Lewis , 2001; Kaltwasser et al .,2002). Была сконструирована серия векторов, несущих разные варианты гена gfp : gfpmutI ( pSG 1151, pSG 1164, pSG 1154, pSG 1729) и gfpuv ( pSG 1156, pSG 1170) ( Lewis P . J , Marston , 1999; рис.11 a , описание ниже). Продукты данных генов ( GFPmut 1 и GFPuv ) представляют собой мутантные белки, обладающие по сравнению c природным GFP большей яркостью и различающиеся по спектру излучения.

Последнее свойство позволяет параллельно проследить локализацию в одной клетке молекул двух типов белков сшитых с разными формами GFP (т.е. проводить двойное мечение клеток). Векторы pSG 1151 и pSG 1156 (рис.11 a ). При использовании этих векторов участок гена, кодирующий С-концевой фрагмент исследуемого белка, вставляется перед gfp . В результате интеграции в хромосому путём одиночного кроссинговера происходит слияние gfp с нужным геном и гибридный белок экспрессируется с промотора данного гена.

Проксимальнее вставленного вектора будет находиться неполная копия данного гена. При клонировании целого гена с его промотором в вектор, экспрессироваться будет как гибридный белок, так и белок дикого типа. Это необходимо если исследуемый белок является необходимым для клетки, а гибридный белок не полностью функционален.

Векторы pSG 1164 и pSG 1170 сходны с описанными выше.

Однако они несут индуцируемые промоторы: ксилоз-зависимый Pxyl ( pSG 1164) и IPTG -зависимый Pspac ( pSG 1170). Это позволяет контролировать экспрессию дистальнее расположенных хромосомальных генов, если вставка произошла внутрь оперона.

Векторы pSG 1154 и pSG 1729 созданы для интеграции слитых генов в сайты amyE хромосомы B . subtilis путём двойного кроссинговера.

Нужный ген сшивается с последовательностью гена gfp кодирующей N -конец ( pSG 1154) или C -конец GFP ( pSG 1729). В обоих случаях для получения функционального гибридного белка необходимо клонировать всю кодирующую последовательность гена.

Экспрессия гибридного белка находится под контролем ксилоз-индуцируемого промотора Pxyl .

a)

FP	вектор
GFPmut 1	pSG1151
GFPuv	pSG1156
CFP	pSG1186
YFP	pSG1187
dsRed	pSG1194

FP	вектор
GFPmut1	pSG1129
CFP	pSG1190
YFP	pSG1191

FP	вектор
GFPmut1	pSG1154
CFP	pSG1192
YFP	pSG1193

b)

Рис.11. a ) Векторы, сконструированные для получения белков, слитых с флюоресцирующими белками. MCS - различные полилинкеры; ori - репликативный регион; f 1 ori , место начала генерации одноцепочечной ДНК; Cm , Amp , Spc - гены устойчивости к хлорамфениколу, ампициллину и спектиномицину, соответственно. FP - ген флуоресцентного белка (тип флуоресцентного белка указан в таблице под соответствующим вектором; для pSG 1164: FP = gfp mut 1; pSG 1170: FP = gfp uv ). lacZ - ген b -галактозидазы; lacI - ген репрессора lacI ; amyE - сайты интеграции в хромосому; Pxyl и Pspac - ксилоз-зависимый и IPTG -зависимый промоторы, соответственно; Ppen - промотор пенициллиназы; b ) вектор pSG 1170, предназначенный для проведения слияния белка клеточного деления DivIVA с GFPuv , после интеграции в хромосому. Для проверки эффективности работы векторов, вектор pSG 1170 был использован для выявления локализации белка DivIVA , участвующего в выборе сайта деления (рис.11 b ). Как и предполагалось, белок локализовался на обоих полюсах и в центре делящихся клеток. Было получено ряд производных данных векторов основанных на голубом ( CFP , cyan fluorescent protein ) и жёлтом ( YFP , yellow fluorescent protein ) спектральных вариантах GFP , а также красном флуоресцирующем белке ( DsRed ), не являющимся производным GFP ( Feucht A ., Lewis ., 2001). В первую очередь они были созданы для проведения более эффективного множественного мечения клеток.

Векторы pSG 1186 ( cfp ), pSG 1187 ( yfp ) и pSG 1194 ( dsRed ) (рис.11 a ) являются производными pSG 1151 со следующими изменениями: ( i ) гены флуоресцентного белка с повышенным содержание GC пар; ( ii ) изменён полилинкер, расположенный проксимальнее гена флуоресцентного белка; ( iii ) дополнительный кодон GTG сразу после старт-кодона гена флуоресцентного белка.

Векторы pSG 1190 ( cfp ) и pSG 1191 ( yfp ) являются производными pSG 1729 со следующими изменениями: ( i ) гены флуоресцентного белка с повышенным содержание GC пар ( ii ) дополнительный кодон GTG сразу после старт-кодона гена флуоресцентного белка.

Полилинкеры без изменений.

Векторы pSG 1192 ( cfp ) и pSG 1193 ( yfp ) являются производные pSG 1154 с изменённым полилинкером (как у pSG 1186 и pSG 1186) и дополнительным кодоном GTG сразу после старт-кодона гена флуоресцентного белка.

Данные векторы были использованы для двойного мечения спорулирующих клеток. Была прямо показана последовательная агрегация/дезагрегация белков участвующих в генерации клеточной асимметрии во время споруляции (белки FstZ и SpoIIE ). Не смотря на сходность локализации во время споруляции, сигналы от FstZ - CFP и SpoIIE - YPF были чётко различимы друг от друга. В то же время было показано, что природный белок DsRed малопригоден для мечения клеток B . subtilis . Для характеристики продукта исследуемого гена нужны антитела, с помощью которых можно осуществить обнаружение данного белка. Для получения антител необходимо очистить исследуемый белок и иммунизировать им животное. Эта процедура длительная и дорогая, а полученные антитела часто различаются по своим свойствам. Чтобы обойти эти проблемы был создан набор векторов для пришивания к белкам антигенных детерминант (реагирующая с антителом часть антигена) ( Kaltwasser et al ., 2002): FLAG (искусственно синтезированный пептид), HA (получен из гемагглютинина вируса гриппа) и c - Myc (получен из протоонкогена c - myc человека) длиной 8, 9 и 10 аминокислотных остатков соответственно.

Антитела, специфически распознающие эти антигенные детерминанты, имеются в продаже.

a

b

Рис.12. Векторы для получения гибридных белков. ( a ) Векторы для получения белков сшитых с антигенными детерминантами. ( b ) Векторы для получения белков слитых с флюоресцирующими белками. ori - репликативный регион плазмиды ColE 1; EmR и ApR , гены резистентности к эритромицину и ампициллину, соответственно; lacI - ген репрессора LacI ; Pspac - IPTG -зависимый промотор; t 1 t 2 t 0, терминаторы( l t 0; t 1, t 2 из rrnB ), trpA t , терминатор триптофанового оперона E . coli ; MCS , полилинкер; tag , последовательность, кодирующая антигенную детерминанту( FLAG , cMyc или HA ); FP , ген флуоресцентного белка ( GFP +, CFP или YFP ). На основе вектора pMUTIN 2 ( Vagner et al ., 1998; см. выше) был сконструирован вектор pMUTIN - Ter (рис.12а). На его основе, путём вставки последовательностей, кодирующих соответствующие антигенные детерминанты, были получены векторы pMUTIN - FLAG , - cMyc и - HA . Для проведения слияния интересующего белка с этими антигенными детерминантами, 3 -конец гена (около 300п.н.) вставляется непосредственно перед последовательностью, кодирующей антигенную детерминанту.

Нужный гибридный белок будет синтезироваться после интеграции целого вектора в хромосомальный ген путём гомологичной рекомбинации. Если ген является частью оперона, то транскрипция проксимальнее расположенных генов оперона обеспечивается IPTG -зависимым промотором.

Антигенные детерминанты c - Myc и HA могут быть также использованы для очистки гибридных белков путём аффинной хроматографии.

Аналогично на основе pMUTIN - Ter путём вставки последовательностей, кодирующих соответствующие флуорисцирующие белки, были получены векторы pMUTIN - GFP +, - CFP и – YFP (рис.12 b ), позволяющие производить слияние белков, кодируемых хромосомальными генами, с флуоресцирующими белками. Это позволяет проследить локализацию исследуемого белка в клетке.

Функционирование всех шести векторов было протестировано на цитоплазматическом белке HtpG (белок теплового шока) и интегральном мембранном белке FtsH (протеаза). 1.7. Геномные векторы Для клонирования больших участков генома на основе генома Bacillus subtilis 168 создан геномный вектор - BGM вектор ( B acillus G enoMe вектор) ( Itaya et al ., 2000; Itaya et al ., 2003; Kaneko et al ., 2003). В отличие от плазмидных векторов, в которые нужные фрагменты ДНК вставляются путём непосредственного лигирования, введение вставки в BGM вектор происходит путём гомологичной рекомбинации. Для этого BGM вектор должен иметь последовательности гомологичные участкам ДНК, фланкирующим клонируемый фрагмент.

Данные последовательности, называемые LPS (Landing Pad Sequences) ( Itaya et al ., 2000), приготавливаются в плазмиде pBR 322 (или её производных) и вставляются в pBR 322 последовательность генома B . subtilis путём трансформации и общей рекомбинации. LPS составляют 5-10% от клонируемой вставки. Они вставляются вместе с фланкируемым ими маркером, что позволяет в дальнейшем проводить отбор рекомбинантов. LPS вместе с маркером обозначены как LPA ; соответственно плазмиды, с помощью которых осуществляется вставка LPA в геном (в BGM вектор), называются LPA плазмидами, а штаммы B . subtilis со вставкой LPA в геноме – LPA штаммами.

Вставку клонируемого сегмента в BGM вектор производят путём трансформации соответствующего LPA штамма; клонируемый сегмент, заключённый между двумя LPS , интегрируется в хромосому путём гомологичной рекомбинации по обоим LPS . С помощью данной методики были клонированы разнообразные фрагменты ДНК как прокариотического, так и эукариотического происхождения. Так, было клонировано несколько фрагментов генома фотосинтетической бактерии Synechocystis ( Itaya et al ., 2003; рис.13). Эта бактерия была выбрана по двум причинам: известна нуклеотидная последовательность её генома и отсутствие патогенности. В одной серии экспериментов для селекции использовался собственный маркер BGM вектора, позволяющий клонировать любой участок генома. В качестве BGM вектора выступал штамм BEST 7003, несущий две вставки: 4,3- kb последовательности pBR 322 в гене proB и ген устойчивости к неомицину pr - neo вставленный в ген yah . Интегрированная в хромосому последовательность pBR 322 состоит из двух частей: 2.4- kb фрагмент включающий в себя ген b -лактамазы (ген устойчивости к ампициллину) и 1.9- kb фрагмент, включающий ген устойчивости к тетрациклину. ДНК клонируется между этими двумя фрагментами как показано на рис.13. Экспрессия гена neo регулируется промотором Pr фага , с которым способен специфично связываться репрессорный белок c I . Рис.13. Клонирование генома Synechocystis в геномный вектор B . subtilis ( BGM ). BEST 6016 и BEST 7003, геномные векторы для прямой и непрямой селекции.

Структура промежуточного генома показана в скобках. Х означает гомологичную рекомбинацию.

Геномная последовательность pBR 322 представлена жёлтым (часть, содержащая ген b -лактамазы) и синим (часть, содержащая ген устойчивости к тетрациклину) заштрихованными боксами разделёнными сайтом для клонирования. Гены резистентности обозначены заштрихованным кругом (хлорамфеникол), незаштрихованным кругом (эритромицин), заштрихованным треугольником (тетрациклин), заштрихованным ромбом (спектиномицин). Изогнутая стрелка обозначает супрессию промотора Pr продуктом гена CI . [ I ] означает сайт для рестриктазы I - Ppo I . В LPA плазмидах между двумя LPS находился ген cI , кодирующий репрессор CI , и ген устойчивости к спектиномицину; между тетрациклиновой частью pBR 322 и правым LPS находился ген устойчивости к хлорамфениколу. LPA плазмиды были приготовлены в E . coli и затем трансформировались в BEST 7003. В результате трансформанты ( LPA штаммы) становились чувствительными к неомицину (репрессировался cI ) и приобретали устойчивость к спектиномицину и хлорамфениколу (маркеры из LPA ). Далее LPA штаммы трансформировались препаратом генома дикого штамма Synechocystis PCC 6803. Вставка части генома Synechocysti s замещала фрагмент cI - spcR , в результате чего дерепрессировался neo и терялся маркер устойчивости к спектиномицину.

Поэтому клоны устойчивые к неомицину и чувствительные к спектиномицину несли нужную вставку. Таким образом, были клонированы три сегмента генома Synechocysti s : A , B и C длиной 26-, 38-, 43- kb соответственно). Для каждого сегмента создавались свои LPS , LPA плазмиды и LPA штаммы.

Попытки клонировать сегменты длиннее 50 kb оказались безуспешными.

Поэтому в другой серии экспериментов был использован метод прямой селекции (рис.13), который также был применён для количественной оценки зависимости эффективности клонирования от размера вставки. Из дикого штамма Synechocystis PCC 6803 был получен мутантный штамм BUSY 1001, который в гене rnhB содержит вставку гена устойчивости к спектиномицину.

Данный маркер и использовался для проведения прямой селекции рекомбинантов со вставкой генома Synechocystis . В качестве BGM вектора выступал штамм B . subtilis BEST 6016, несущий последовательность pBR 322, вставленная в ген proB (как и BEST 7003), а также ген устойчивости к неомицину [ Pr - neo ], вставленный в ген yvfC (неомициновый маркер BEST 6016 в данных экспериментах не использовался). В LPA плазмидах между двумя LPS находился ген устойчивости к эритромицину, и LPA штаммы отбирали по этому маркеру. Таким образом, были созданы 4 штамма B . subtilis для клонирования сегментов, содержащих rnhB :: spc , длиной от 14 до 77 kb . После трансформации препаратом генома Synechocystis BUSY 1001 шёл прямой отбор рекомбинантов по их устойчивости к спектиномицину. Было показано, что эффективность клонирования понижается с увеличением размера клонируемого сегмента. С помощью BGM вектора BEST 6016 также был клонирован 120- kb фрагмент геномной ДНК мыши ( Itaya et al .,2000). Клонирование фрагмента шло в несколько этапов (рис.14). Сначала в BEST 6016 клонировали первый фрагмент длиной 20 kb , а затем путём трансформации и гомологичной рекомбинации к нему были добавлены несколько фрагментов, в результате чего он был удлинён до 120 kb . Все проведённые манипуляции были аналогичны описанным выше. С помощью BGM вектора BEST 7003 был клонирован ген мыши jumonji ( jmj ) ( Kaneko et al ., 2003). Данный ген имеет размер около 200 kb . Предполагалось, что с первым интроном длиной 90 kb взаимодействуют какие-то белковые факторы, благодаря чему происходит регуляция экспрессии данного гена. Чтобы проверить это, были получены фрагменты данного интрона разной длины. Для этого в вектор BEST 7003 аналогично описанной процедуре ввели 110 kb фрагмент гена, включающий первые два интрона. Далее с помощью гомологичной рекомбинации была произведена серия делеций (рис.15) и были получены несколько сегментов первого интрона различной длины.

Процесс введения делеций по сути является обратным процессу удлинения фрагмента.

Фрагмент ДНК мыши ( p 185 A 21)

BEST2257

[1]

[2]

[3]

Рис.14. Объединение двух фрагментов ДНК мыши длиной по 25 kb в один фрагмент длиной 50 kb . S 2, S 1, M 1 - LPS -последовательности. BEST 2257, BGM вектор BEST 6016 со вставкой первого 25 kb фрагмента. neo , ген устойчивости к неомицину, Показаны следующие этапы: [1] клонирование S 1и S 2 в плазмиде производной pBR 322 (между S 1и S 2 расположен гены cI ); [2] вставка в BEST 2257 фрагментов S 1и S 2 вместе с геном cI ( neo продуктом гена cI ). Вставка происходит в результате гомологичной рекомбинация по LPS -последовательности S 1 и части pBR 322 последовательности; [3] замещение cI вторым 25 kb фрагментом. Во всех вышеописанных экспериментах клонированные в геномном векторе сегменты реплицировались как часть генома B . subtilis , поэтому они проявляли высокую структурную и сегрегационную стабильность.

Клонированная ДНК стабильно сохранялась в геноме даже при выращивании в неселективной среде. При этом скорость роста рекомбинантов со вставкой части генома была такой же, как и у клеток без вставки.

Маркеры (гены устойчивости)

LPS ( внутренний участок вставки)

Сайт распознавания I - PpoI

Последовательности pBR322

Рис.15. Осуществление делеции участка клонированного фрагмента.

Вверху: схема клонированного фрагмента гена jmj (длина фрагмента 110 kb ). Белые прямоугольники, экзоны. Внизу: делеция участка длиной 24 kb путём гомологичной рекомбинации по двум LPS (внутренний участок вставки и участок последовательности pBR 322). Полученные результаты показывают, что в геномном векторе можно клонировать ДНК практически любой типа.

Приготовление двух фланкирующих сегментов перед созданием BGM неизбежно, однако позволяет осуществлять позиционное клонирование молекул ДНК размерами, превышающими лимит технологии ПЦР. Клонирование с помощью геномного вектора имеет несколько преимуществ по сравнению с клонированием с помощью плазмидных векторов.

оценка стоимости нематериальных активов в Липецке
оценка авторских прав цена в Белгороде
оценка машин для наследства в Москве