Репликация ДНК

Замечательной особенностью ДНК является то, что она несёт гены кодирующие эти белки, и, таким образом, информация о механизме её собственного удвоения закодирована в ней самой. Общий механизм репликации.

Точное самовоспроизведение ДНА возможно благодаря её особой структуре.

Модель структуры ДНК была обнародована Ф.Криком и Д.Уотсоном в 1953 году.

Согласно ей ДНК представляет собой длинную двухцепочечную полимерную молекулу.

Мономерами являются нуклеотиды, соединённые в каждой цепи фосфодиэфирными связями.

Сахарофосфатный остов молекулы, который состоит из фосфатных групп и дезоксирибозных остатков соединённых 5'-3'-фосфодиэфирными связями , образует как бы боковины винтовой лестницы, а пары оснований -её ступеньки. Две полинуклеотидные цепи навиты одна на одну, образуя двойную спираль.

Вместе они удерживаются водородными связями , образующимися между комплиментарными основаниями противоположных цепей (между А и Т; G и C ). Цепи молекул ДНК антипараллельны: одна из них имеет направление 5 ® 3 , другая 3 ® 5 . Последовательность мономерных единиц (дезоксирибонуклеотидов) в одной её цепи соответствует (комплиментарна) последовательности дезоксирибонуклеотидов в другой. Уотсон и Крик предположили, что для удвоения ДНК должны произойти разрыв водородных связей и расхождение цепей(рис.1) и что удвоение ДНК происходит путём последовательного соединения нуклеотидов на матрице материнской цепи в соответствии с правилом комплиментарности. В дальнейшем эта матричная природа механизма репликации была подтверждена многочисленными опытами.

Подтверждение также получил предложенный полуконсервативный способ репликации двухцепочечной ДНК {Мезельсон, Сталь, 1958 (объектE . coli ); Тэйлор,1958( объектVicia faba )}.Согласно ему, в результате дупликации образуются две пары цепей, в каждой из которых только одна является родительской (консервативной), а втораязаново синтезированной.

Другие механизмы (консервативный, дисперсный) не подтвердились.

рис.1 . Рис.1 Модель репликации, предложенная Уотсоном и Криком. Комплиментарные цепи показаны разными цветами.

зоны, где происходила репликация. Эта зона двигалась вдоль родительской двойной спирали. Из-за Y -образной структуры её назвали репликативной вилкой.

Именно в ней и происходят основные процессы, обеспечивающие синтез ДНК. Вилки образуются в структуре, называемой репликативный пузырёк. Это области хромосомы, где две нити родительской спирали ДНК разъединяются и служат как матрицы для синтеза ДНК. Это место, где происходит инициация репликации, называется точкой начала репликации (точкой ori ). Образование репликативных вилок происходит в двух направлениях (двунаправленная репликация) и их они затем движутся до встречи с другой вилкой или с концом матрицы. В некоторых случаях наблюдается движение только одной вилки, тогда как вторая является стационарной (однонаправленная репликация). У прокариот на нуклеоиде находится обычно только одна точка ori , тогда как у эукариот их много (например, у дрожжей порядка 500), расположенных на хромосоме на расстоянии 20-35 т.п.н.

Участок между двумя точками ori получил название репликон.

Скорость репликации у прокариот составляет порядка 1000-2000 нуклеотидов в секунду, у эукариот ниже из-за нуклеосомной организации хроматина (10-200 нуклеотидов в секунду). Скорость репликации всей молекулы ДНК (или хромосомы) зависит от числа и расположения точек ori . Синтез ДНК в репликативной вилке проходит следующим образом. Цепи синтезируются в результате присоединения 5 -дезоксинуклеотидильных единиц дезоксирибонуклеотидтрифосфатов к 3 -гидроксильному концу уже имеющейся цепи (праймер, затравка). За один акт репликации праймерная цепь удлиняется на один нуклеотид, при этом одновременно удаляется один остаток пирофосфата. Цепи синтезируются в направлении 5 ® 3 вдоль матричной цепи, ориентированной в противоположном, 3 ® 5 , направлении.

Синтез Цепей в обратном направлении не происходит никогда, поэтому синтезируемые цепи в каждой репликативной вилке должны расти в противоположных направлениях.

Синтез одной цепи(ведущей, лидирующей) происходит непрерывно, а другой (отстающей) импульсами. Такой механизм репликации называется полунепрерывным.

Ведущая цепь растёт от 5 - к 3 -концу в направлении движения репликативной вилки и нуждается только в одном акте инициации. Рост отстающей цепи также идёт от 5 - к 3 -концу, но в направлении противоположном движению репликативной вилки. Для синтеза отстающей цепи должно произойти несколько актов инициации, в результате чего образуется множество коротких цепей, называемых фрагменты Оказаки в честь открывшего их учёного - Р.Оказаки.

Размеры их: 1000-2000 нуклеотидов у прокариот, 100-200 нуклеотидов у эукариот. По мере движения репликативной вилки концы соседних фрагментов Оказаки соединяются с образованием непрерывной отстающей цепи.

Механизмы инициации репликации в точке ori и при образовании фрагментов Оказаки в принципе аналогичны. В обоих случаях происходит образование РНКзатравок (длиной 10-12 нуклеотидов), комплиментарных матричной ДНК, в виде продолжения которых синтезируется новая цепь ДНК. В дальнейшем короткие вставки РНК замещаются сегментами ДНК, которые затем объединяются с образованием непрерывных цепей.

Основные ферменты репликации.

Репликация является ферментативным процессом, а не спонтанным как сначала предполагали Уотсон и Крик. В репликации участвуют следующие основные группы ферментов. ДНК-полимеразы.

Ферменты, которые узнают нуклеотид материнской цепи, связывают комплиментарный нуклеозидтрифосфат и присоединяют его к 3 -концу растущей цепи 5 -концом. В результате образуется 5 -3 -диэфирная связь, высвобождается пирофосфат и растущая цепь удлиняется на один нуклеотид. Таким образом, ДНК-полимераза движется от 3 - к 5 -концу молекулы материнской ДНК, синтезируя новую цепь. ДНК-полимеразе для работы нужен праймер (т.е. 3 -ОН группа для присоединения нового нуклеотида) и матрица, детерминирующая присоединение нужного нуклеотида. ДНК-полимеразы помимо полимеразной активности, имеют экзонуклеазную активность, они способны к гидролизу фосфодиэфирных связей в одной цепи ДНК или на не спаренном конце дуплексной ДНК. За один акт удаляется один нуклеотид, начиная с 3 -конца цепи (3 -5 -экзонуклеаза) или с 5 -конца цепи дуплексной ДНК (5 -3 -экзонуклеаза). Эти различные активности присущи разным сайтам полипептидной цепи ДНК-полимераз. 3 -5 -экзонуклеазная активность обеспечивает контроль за присоединением каждого нуклеотида и удаление ошибочных нуклеотидов с растущего конца цепи. Все ДНК-полимеразы способы осуществлять данный тип реакции.

Многие(но не все) ДНК-полимеразы обладают также 5 -3 -экзонуклеазной активностью. При сочетании 5 -3 -экзонуклеазной и полимеразной активностей происходит последовательное отщепление нуклеотидов с 5 -конца одноцепочечного разрыва в дуплексе и удлинение цепи с 3 -конца. В результате место разрыва перемещается по цепи в направлении от 5 - к 3 - концу(так называемая ник-трансляция). ДНК-лигазы --ферменты, осуществляющие соединение цепей ДНК, т.е. катализирующие образование фосфодиэфирных связей между 5 -фосфорильной и 3 -гидроксильной группами соседних нуклеотидов в местах разрывов ДНК. Для образования новых фосфодиэфирных связей требуется энергия в форме АТФ либо НАД. ДНК-геликазы (ДНК-хеликазы)—ферменты, осуществляющие расплетание двойной спирали ДНК. Для разделения цепей используется энергия АТФ. Геликазы часто функционируют в составе комплекса, осуществляющего перемещение репликативной вилки и репликацию расплетённых цепей. Для расплетания достаточно одного геликазного белка, но для того. Чтобы максимизировать скорость раскручивания.

Несколько геликаз могут действовать совместно.

Рис.2 Геликазная активность белка DnaB E . coli [3].

ДНК-топоизомеразы—ферменты, изменяющие степень сверхспиральности и тип сверхспирали. Путём одноцепочечного разрыва они создают шарнир, вокруг которого нереплецированный дуплекс ДНК, находящейся перед вилкой, может свободно вращаться. Это снимает механическое напряжение, возникающее при раскручивании двух цепей в репликативной вилке, что является необходимым условием для её непрерывного движения. Кроме того, топоизомеразы (типа II ) обеспечивают разделение или образование катенанов - сцепленных кольцевых ДНК (образуются в результате репликации кольцевой ДНК), а также устранение узлов и спутанных клубков из длинной линейной ДНК. Существует два типа топоизомераз.

Топоизомеразы типа I уменьшают число сверхвитков в ДНК на единицу за один акт. Эти топоизомеразы надрезают одну из двух цепей, в результате чего фланкирующие дуплексные области могут повернутся вокруг интактной цепи, и затем воссоединяют концы разрезанной цепи. Эта реакция не требует энергии АТФ, т.к. энергия фосфодиэфирной связи сохраняется благодаря тому, что тирозиновый остаток в молекуле фермента выступает то в роли акцептора, то в роли донора фосфорильного конца разрезанной цепи.

Рис.3 Действие топоизомеразы I ( Topo I ). [3.]

Топоизомеразы типа II вносят временные разрывы в обе комплиментарные цепи, пропускают двухцепочечный сегмент той же самой или другой молекулы ДНК через разрыв, а затем соединяют разорванные концы. В результате за один акт снимаются два положительных или отрицательных сверхвитка. Топоизомеразы типа II тоже используют тирозиновые остатки для связывания 5 -конца каждой разорванной цепи в то время . когда другой дуплекс проходит через место разрыва.

Праймаза—фермент, обладающий РНК-полимеразной активностью; служит для образования РНК-праймеров, необходимых для инициации синтеза ДНК в точке ori и дальнейшем для синтеза отстающей цепи.

Рис.4 Действие топоизомеразы II : ( a ) образование отрицательных сверхвитков, ( b ) разделение и образование катенанов [3].

Репликация у прокариот. Escherichia coli . У этой бактерии (как и ещё некоторых исследованных видов) в области точки инициации репликации ( ori C , длиной примерно 245 п.н.) находятся повторы размером в 13 и 9 пар оснований (Рис.5). При инициации 10-20 молекул белка инициации репликации Dna A связывается с четырьмя девятимерными повторами (9- mers ) и расплетает ДНК в районе тандемного набора тринадцатимеров, богатых АТ парами (что облегчает их расплетание, т.к. между А и Т только две водородные связи). Белок Dna C доставляет шестисубъединичный белок Dna B (геликаза) к матрице. На каждую из одиночных цепей садится по одному Dna B и они затем двигаются в разных направлениях расплетая ДНК.

Рис.5 Модель инициации репликации в ori C E . coli . [3].

Две ДНК-полимеразы с помощью своих двух b -субъединиц прикрепляются к нити ДНК и начинают синтез ДНК. Расплетанию спирали способствует SSB -белки, которые связываются с одноцепочечными участками ДНК, предотвращают образование шпилек и тем самым стабилизируют расплетённый дуплекс.

Сбалансированное действие топоизомеразы II (гираза), способной индуцировать отрицательные сверхвитки(см.рис.4), и топоизомеразы I , снимающей отрицательные сверхвитки(см.рис.3) регулирует степень сверхспиральности ДНК и таким образом влияет на скорость движения репликативной вилки. У прокариот обнаружено три типа ДНК-полимераз. Их свойства приведены ниже.

Свойство / тип полимеразы	I	II	III
полимеризация: 5 -3	+	+	+
экзонуклеазная активность:
5 --3	+	+	+
3 --5	+	--	--
синтез на:
ДНК без праймера	--	--	--
одноцепочечная ДНК с праймером	+	--	--
одноцепочечная ДНК с праймером и SSB-белками	+	--	+
скорость синтеза (нуклеотиды в минуту)	600	?	30000
Табл.1 Свойства ДНК-полимераз E . coli [3]. количество молекул в клетке	400	?	10--20

III осуществляет удлинение лидирующей цепи, а также удлинение РНК-праймеров с образованием фрагментов Оказаки длиной от 1000 до 2000 нуклеотидов. Две ДНК-полимеразы связаны между собой tсубъединицей.

Удаление сегментов РНК с 5 -конца каждого фрагмента Оказаки и заполнение пробелов между ними катализирует c я ДНК-полимеразой I ,способной удлинять цепь и осуществлять ник-трансляцию. Когда растущий 3 -гидроксильный конец каждого фрагмента Оказаки доходит до 5 –дезоксинуклеотидного конца соседнего фрагмента, вступает в действие ДНКлигаза и образуется непрерывная отстающая цепь. Роль ДНК-полимеразы II в репликации не выяснена.

Обнаружен специальный белок терминации – Tus -белок. Он задерживает геликазу, в результате чего прекращается расплетение нити и происходит терминация репликации.

Рис.6 Синтез ДНК в репликативной вилке. [2]

Репликация у эукариот. Как и в случае с E . coli исследования репликации в эукариотических клетках сначала были сосредоточены на характеристике различных ДНК-полимераз (см. табл.2).

свойство / тип полимеразы	a	b †	d	g	e
полимеризация: 5 -3	+	+	+	+	+
экзонуклеазная активность: ‡ 3 -5	--	--	+	+	+
синтез от:
ДНК-праймера	+	+	+	+	+
РНК-праймера	+	--	--	+	?
связь с ДНК-праймазой	+	--	--	--	--
расположение в клетке:
ядро	+	+	--	+	+
митохондрии	--	--	+	--	--

Табл.2 Свойства ДНК-полимераз клеток млекопитающих * . * ДНК-полимеразы дрожжей аналогичны полимеразам a , b , g соответственно † ДНК-полимераза наиболее активна на молекулах ДНК с брешами около 20 нуклеотидов и предположительно участвует в репарации ДНК ‡ FEN 1 - эукариотическая 5 -3 экзонуклеаза, удаляющая РНК-праймеры; по своей структуре и функциям она схожа с доменом ДНК-полимеразы I E . coli имеющего 5 -3 экзонуклеазную активность. [3]. Следующим этапом стало создание систем для репликации хромосом вирусов животных in vitro . В результате в настоящее время хромосома вируса SV 40 может быть реплицирована in vitro с использованием всего лишь восьми компонентов клеток млекопитающих. По своим свойствам эти белки напоминают белки необходимые для репликации в E . coli . Репликация ДНК эукариот также идёт в двух направлениях; для синтеза ДНК нужны праймеры синтезируемые праймазой; синтез лидирующей цепи непрерывен, а отстающей прерывистый. Как показано на рис.7, инициация репликации ДНК вируса SV 40 происходит в уникальном сайте, точке начала репликации, путём связывания кодируемого вирусом белка, называемого T antigen , или T ag . Этот полифункциональный белок расплетает дуплекс ДНК благодаря своей геликазной активности.

Расплетание дуплекса требует также наличия АТФ и белка репликации A ( RPA ), кодируемого клеткой-хозяином и обладающего способностью связываться с однонитчатой ДНК (как SSB -белки в E . coli ). Одна молекула ДНК-полимеразы (Pol ) прочно связывается с праймазой и затем связывается с образовавшейся однонитчатой ДНК. Праймаза образует РНК-праймеры, которые затем удлиняются на небольшую длину Pol , образуя первую часть ведущих цепей, которые растут от точки ori в противоположных направлениях.

Активность Pol стимулируется фактором репликации C ( RFC ). Затем c 3-концам b удлинённых Pol РНК-праймеров связывается PCNA (proliferating cell nuclear antigen) и замещает Pol на обоих растущих ведущих цепях, прерывая их синтез. На следующем этапе Pol связывается с PCNA на 3 -концах растущих цепей. PCNA повышает процессивность Pol так, что полимераза может непрерывно продолжать синтез ведущих цепей. Таким образом, функция PCNA аналогична функции -субъединицы полимеразы III E . coli , т.к. оба белка образуют сходные структуры (“кольца”), охватывающие ДНК и способствующие удержанию полимераз на цепи ДНК. Они, однако, имеют различные первичные структуры; кроме того PCNA -тример, а не димер как -субъединица полимеразы III E . coli . Комплекс праймазаPol . садится на цепь, являющуюся матрицей для отстающей цепи и вместе с RFC осуществляют синтез запаздывающей цепи. Наконец, как и в E . coli топоизомеразы снимают механическое напряжение, возникающее при расплетании ДНК в репликативной вилке, и участвуют в разделении двух дочерних хромосом. Однако топоизомеразы эукариот имеют некоторые отличия от прокариотических: 1.топоизомеразы I эукариот взаимодействуют с 3 -фосфорильным концом разорванной цепи (прокариотические --с 5 -фосфорильным концом) 2. топоизомеразы I эукариот устраняют как отрицательные, так и положительные сверх витки (прокариотические—только отрицательные) 3.топоизомеразы II эукариот не способны индуцировать образование отрицательных сверхвитков (как это делает в релаксированных кольцевых ДНК гираза бактерий). Итак, получено много данных об эукариотических белках, осуществляющих репликацию ДНК вируса SV40 in vitro. Как упоминалось ранее, инициация репликации ДНК SV 40 in vitro требует наличие вирусного белка - T антигена. Для инициации же репликации у эукариот хромосомной ДНК необходим целый комплекс белков. Так, у дрожжей с сайтом ori в течение всего жизненного цикла связан комплекс из 6 разных белков ( ORC ), к которому в интерфазе присоединяется ещё целый ряд белков и образованный комплекс инициирует процесс репликации. Такие же белки синтезируются всеми эукариотическими клетками.

Рис.7 Модель репликации ДНК вируса SV 40 in vitro с помощью эукариотических ферментов. [3.]

Хромосомы эукариот линейны и их концы представлены теломерами, состоящими из повторяющихся олигомерных последовательностей; у человека это 25-200 копий последовательности TTAGGG . Наличие специальной области на концах эукариотических хромосом абсолютно необходимо. Дело в том, что при удалении последнего РНК-праймера отстающей цепи, на 5-конце этой цепи остаётся брешь, которую не способна заполнить ни одна из ДНК-полимераз, т.к. всем им для работы необходим праймер со свободным 3-ОН концом. Без существования какого-либо специального механизма дочерняя нить ДНК, синтезируемая на отстающей цепи, укорачивалась бы с каждым клеточным делением.

Ферментом, предотвращающим такое укорочение, является теломераза. Этот фермент имеет ассоциированную с ним короткую нить РНК, комплиментарную шестичленной последовательности, повторяющейся в теломере и служащую матрицей для синтеза ДНК теломеров. Благодаря этому механизму эукариотические хромосомы могут реплицироваться полностью.

Репликация в большинство соматических клеток проходит без участия теломеразы, поэтому с каждым делением длина хромосом клетки укорачивается и после определённого числа делений хромосомы утрачивают теломеры и начинают терять смысловые участки , что приводит к гибели клетки.

Теломераза активна в половых, раковых клетках и клетках одноклеточных эукариот.

Заключение. Нужно отметить, что существует ряд объектов, репликация которых проходит по несколько иному механизму, чем было описано выше. Так, например, кольцевая ДНК митохондрий и хлоропластов реплицируется с образованием D -петель (сначала начинает реплицироваться одна цепь, в результате чего образуется структура в форме D , а после репликации более половины первой нити, начинает синтезироваться вторая); ряд плазмид и ДНК некоторых вирусов реплицируется по типу катящегося кольца и т.п.

оценка для нотариуса в Белгороде
оценка коттеджей в Курске
оценка стоимости коммерческой недвижимости в Твери